Western blot (tuntud ka kui immunoblot) on laborites laialt levinud meetod spetsiifiliste valkude ja peptiidide tuvastamiseks. Seda kasutatakse sageli näiteks molekulaarbioloogia ja biokeemia laborites, et uurida valguekspressiooni, identifitseerida valke ning analüüsida valk-valk interaktsioone.

Western blot meetod hõlmab mitmeid etappe alates membraani ettevalmistamisest kuni tuvastamise ja visualiseerimiseni. Oleme koostanud juhise, mis aitab selles protsessis paremini orienteeruda.

Brošüür:

Nipid & nõuanded:

1. Proovi ettevalmistus:
   • Valkude terviklikkuse säilitamiseks käitle ja säilita proove nõuetekohaselt (mõjutavad faktorid on muuhulgas temperatuur, pH, metalliioonid, kemikaalid, detergendid, aga ka lihtsalt aeg).
   • Kasuta värskeid ja kõrge kvaliteediga proove, et vältida valkude lagunemist ja kadusid.
   • Vali ekstraheerimismeetod vastavalt proovitüübile (rakulüüs, sadestamine, tsentrifuugimine, kolonnkromatograafia, membraanfiltratsioon vm meetod).
   • Proovide laadimiseks optimeeri valgukontsentratsioon, kasutades valguanalüüsi, nt Bradfordi või BCA analüüsi.
     
2. Geelelektroforees:
   • Vali sobiv polüakrüülamiidgeeli protsent vastavalt uuritava valgu suurusele. Üldiselt kehtib rusikareegel, et mida väiksem valk, seda suurema protsendiga geel:
     4–40 kDa 20%
     12–45 kDa 15%
     10–70 kDa 12.5%
     15–100 kDa 10%
     25–200 kDa 8%
     NB! Akrüülamiid on potentsiaalselt kumlatiivne neurotoksiin, seega kanna alati sellega töötades kindaid.
     
   • Saadaval on ka gradientgeelid, mis sobivad erinevate suurustega valkudele.
   • Jälgi, et proovid oleks õigesti geelile kantud ning erinevatel radadel oleks võrdne proovikogus (väldi ülekoormust – hea tava on laadida rajale ca 75% täismahust, et vältida proovi külgnevatele radadele kandumist).
   • Lisa ka molekulmassi markerid, mis aitavad valgu suurust hinnata.
3. Valgu ülekanne:
   • Optimeeri ülekandetingimused (aeg, pinge, puhver) vastavalt valgu molekulmassile.
   • Kasuta sobivaid membraane (nitrotselluloos või PVDF) vastavalt valgu omadustele ja detekteerimisviisile.
   • Kasuta kvaliteetset filterpaberit (nt Sartorius blottimise paber)
4. Blokeerimine:
   • Blokeeri membraan sobiva blokeerimisainega (nt NFDM või BSA), et takistada antikehade mittespetsiifilist seondumist.
   • Vajadusel optimeeri blokeerimistingimusi (aeg ja temperatuur), et vähendada taustasignaali.
5. Antikehad ja detekteerimine:

• Vali sobivad primaarsed antikehad.
• Optimeeri antikeha kontsentratsioonid ja inkubatsiooniajad, et saavutada parim signaali ja taustasignaali suhe.
• Kaalu sekundaarsete antikehade ja ensüümide (nt HRP) või fluorofooride kasutamist.
• Uuri erinevaid detektsioonimeetodeid, nt kemiluminestsentsi või fluorestsentsi põhine detekteerimine.
  • Kui soovid tugevamat signaali ning kasutada vähem antikeha, siis sel juhul on abiks:
    1) Western Lightning™ ONE – Eelsegatud ühekomponentne kemoluminestsents-HRP substraat, mis pakub ühtsemate tulemuste saavutamiseks valgutundlikkust alates pikogrammist kuni femtogrammini.
    2) Western Lightning™ – Kahekomponentne kemoluminestsents-HRP substraat usaldusväärseks ja tundlikuks valgu tuvastamiseks.

• Tulemuste otseseks kolorimeetriliseks visualiseerimiseks ilma filmi või seadmeid kasutamata, on valikus kromogeensetes analüüsides kasutatavad DAB ja BCIP/NBT substraadid:
  
  • 1) DAB, et detekteerida HRP-d
  • 2) BCIP/NBT, et detekteerida aluselist fosfataasi (AP)
    

6. Andmeanalüüs:

• Kasuta sobivat kvantifitseerimistarkvara (nt ImageJ), et bändide intnsiivsust analüüsida.
• Täpse võrdluse jaoks normaliseerige valgu ekspressioonitasemed kontrolli abil (nt GAPDH või β-aktiiniga).
• Proovide vaheliste oluliste erinevuste määramiseks teosta statistiline analüüs.

7. Optimeerimine:

• Kui signaal on liiga madal ja taustasignaal intensiivne, optimeeri blokeerimistingimusi, antikehade kontsentratsiooni ja pesuetappe.
• Kontrolli antikehade spetsiifilisust positiivsete ja negatiivsete kontrollide abil.
• Kontrollige ülekande edukust, värvides membraani enne blokeerimist Ponceau S-ga.

Pea meeles, et Western blot analüüs võib olla keeruline tehnika ja optimeerimine on usaldusväärsete ja reprodutseeritavate tulemuste võti. Konkreetse eksperimendi jaoks optimaalsete tingimuste saavutamiseks võib vaja minna mitu katset. Soovitame enne katse teostamist ühendust võtta meie spetsialistidega, kes oskavad anda soovitusi kiiresti optimaalsete tulemuste saavutamiseks.

Vaata ka Western Blot lahenduste brošüüri Revvitylt (end. PerkinElmer):

Küsimuste korral võtke julgelt ühendust meie tootejuhiga:

Signe Mooses
+372 5787 7726
signe@novabio.ee
www.novabio.ee